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恶性疟原虫对青蒿素为基础的联合疗法展品增强突变,提高皮质醇和TNF-α归纳

   发布时间:2018-09-29   [点击量:147]  


介绍

恶性疟原虫的疟蚊传播,是最常见的病原体在撒哈拉以南的非洲的疟疾。临床疟疾流行地区的特点是模糊的症状区别其他疾病的优势区域的疟疾地方的特性,导致疟疾定义在诊断带来困难加上过度治疗(1- - - - - -2]。疟疾的临床特征包括发热性疾病和发冷,可以诱导内源性药物如炎性细胞因子和压力荷尔蒙。疟疾发热出现寄生虫阈值的依赖。可接受的火成的阈值是600年到1500年的最低每毫升血液寄生虫对恶性疟原虫(3.]。这一概念展开的亲缘临床疟疾发烧寄生虫血症火成的阈值是非常重要的。然而,永久的无症状的寄生虫血症患病率高流行地区使寄生虫疾病定义阈值就不足。因此,它是引人注目的,以确定其他中央的角色球员的表现与持久的投诉想到通常指定为疟疾。在这方面,尽管存在一个新兴领域的调查关于改变生理稳态诱发可能论述的应激激素和细胞因子(4- - - - - -7),这不是考虑到治疗的判断由于强调的出现耐药基因。

抵抗,定义为“一种寄生虫的能力生存和/或用药物的存在”(8),引起越来越多的关注。自全球采用青蒿素的联合疗法(ACT)在2006年作为简单的一线治疗疟疾,有报道称疟疾发病率下降和疟疾有关的死亡率在2010年和2015年之间(9青蒿素耐药性],然而,据报道在柬埔寨西部[10)和东南亚(11]暗示的可能性发生在世界的其他地方12- - - - - -14]。耐药基因型的选择与药物接触不足有关要么由于用药不当,正确选择治疗方法如缺乏承诺使用推荐的行为(15- - - - - -16),药代动力学性质差,假药或其他感染在药物消除阶段获取的(8,17]。几个基因已经被归因于对抗疟药物的耐药性,例如,抗氯喹恶性疟原虫疟疾与pfcrt基因的点突变(18- - - - - -20.),Pfmdr1突变与耐氯喹,奎宁,monodesethylamodiaquine,双氢青蒿素含量测定甲氟喹合成,lumefantrine,21- - - - - -22]。如果遗传多态性和功能表型转化为有效,然后,新兴kelch 13(K13)螺旋桨基因的多态性在东南亚与青蒿素耐药性有关的[23- - - - - -24)将对全球疟原虫治疗可能带来灾难性的后果。重要的是,没有任何一致的这种突变的报道出现在非洲有一个例外(25].

个人抗疟治疗病理生理的反应各不相同,可以交感性的压力,最终在瞬态或持续治疗后想到没有定义角色寄生虫遗传多态性。例如,糖皮质激素、皮质醇和地塞米松等可以抑制促炎细胞因子及其受体,天平从Th1、Th2发展和促炎反应抗炎反应(26]。促炎细胞因子如TNF-α、il - 12和IFN-γ已经证明对红细胞的疟疾(保护性免疫的重要介质27- - - - - -28]。缺乏知识是否生产过剩的促炎细胞因子提高了控制疟疾感染的能力或致使病人发展成严重的疟疾29日),这就需要分析的临床样本在流行地区。相关的问题是是否后处理持久性血液中的疟原虫伴随着持续想到仅仅归因于感染病人的耐药疟疾。我们假设像治疗后的症状,即使疟疾寄生虫存在于血涂片在疟疾流行地区,可能是由于多种因素,如药物的影响,如疲劳、轻微到严重发热、恶心、轻度发冷、头晕,促炎的条件和障碍,调节细胞因子的功能。我们测试这个假说通过分析疟疾积极血液样本被归类为(i)治疗(此前接受行为治疗);和(2)未经处理(没有接受行为治疗);和一个额外的8疟疾-个人控制。因此,这种病例对照设计(行为治疗和未经处理的情况下参加诊所)满足随机干扰结果通过使用非指定的药物。Pfcrt malaria-positive样本分析突变,Pfmdr1,和K13 kelch基因,当所有样本分析水平的细胞因子和糖皮质激素。

材料和方法

研究人口和样品

伦理和人类被试委员会医学院拉各斯大学批准用于本研究的协议(协议# CMUL / HREC / 05/17/205)。研究参与者和/或其监护人提供书面知情同意和/或批准。合作调查者在疾病控制和预防中心(CDC)获得许可从CDC人体办公室参与的pcr在匿名条件下样品没有任何个人识别信息。

患者人群代表个人参加门诊在拉各斯,尼日利亚与投诉相关的临床症状与疟疾。所有研究对象都必须完成专业监督的调查问卷。二十6疟疾患者积极的血液(经显微镜和qPCR)分为(i)12人参加诊所先前使用(例)治疗和行为治疗疟疾(ii)14人参加诊所第一次抱怨与疟疾和相关测试malaria-positive(未经处理的情况下)。最后的血清样本用于每个类别变化从3到10根据血清的可用性。额外的8样本收集从一个个体组成的对照组是没有症状的急性疾病筛查,没有证据或慢性疾病史,没有寄生虫血症在他们的血液检查。选择的药物在这个研究以青蒿素为基础的联合疗法,这是一个组合的蒿甲醚和lumefantrine。在所有情况下,静脉血液收集EDTA为疟疾寄生虫检查使用显微技术和qPCR。此外,全血发现绘画纸®# 3滤纸被保留分子研究(基因多态性和基因突变)。等离子体中提取用于细胞因子和皮质类固醇的研究。

DNA提取

从血液斑点或全血基因组DNA被隔离在注册使用QIAamp DNA minikit(试剂盒,瓦伦西亚,CA)根据制造商的指示,根据描述的方法(30.]。DNA是在使用前储存在-200 c。

多路复用Photo-induced电子Transfer-PCR疟原虫DNA扩增

DNA检测在重复使用多路复用photo-induced电子转移(PET)pcr试验使用p . falciparum-specific引物组,Pfrt364,根据引物设计和先前所描述的方法(31日),正向引物5’-CCATTTTACTCGCAATAACGCTGCAT、反向5 ' -CTGAGTCGAATGAACTAGTCGCTA C以下引物改性;反向引物的5 'end改性PET标签和标签与家人(属)和十六进制(恶性疟原虫)。

定量实时PCR检测疟原虫

通过qPCR检测疟原虫物种进行,针对18 s rDNA基因,通过TaqMan实时PCR检测化验所描述的(31日]。截止CT值40.0或以下是用来表示一个积极的结果。

检测K13、pfcrt pfmdr1基因多态性

PCR是用来识别基因多态性在K13,pfcrt,pfmdr1基因。K13螺旋桨域研究使用先前描述的方法(32]。正向引物的5 ' -CGAAATAGTATCTCGAAT和反向引物的5 ' -CTGGGAACTAATAAAGAT被利用。pfcrt和pfmdr1基因调查使用先前描述的方法(33]。对于pfcrt密码子72年到76年,TTTTTCCCTTGTCGACCTTAAC(F)和AGGAATAAACAATAAAGAAATAATCATAC(R)引物利用。pfmdr1密码子1034、1034和1246年,GCATTTAGTTCAGATGATGAAATG(F)和CCATATGGTCCAACATTTGTATC(R)引物被利用。出现青蒿素耐药性的实验室控制样品3 d7,7 g8,W2,HB3,Dd2还包括进行比较。进行数据分析和PCR测序产品使用下一代测序和桑格方法在亚特兰大疾病控制和预防中心。数据质量进行过滤和分析使用Geneious R9机型(www.geneious.com)。只有配对阅读完全映射到参考Pfk13序列(PF3D7_1343700)被用于后续的单核苷酸多态性(SNP)调用(例如,使用Geneious映射到参考和SNP /变异调用者)。

细胞因子测定

IFN-γ精化,TNF-αIL-12p70,il - 10,TGF-β1病人血液样本确定使用商业ELISA试剂盒(研发系统Duoset®)根据制造商的指示。

糖皮质激素测定

皮质醇水平测定使用Thermofisher皮质醇酶联免疫试剂盒,固相竞争酶联免疫吸附试验设备,检测和量化总血清中皮质醇。后续步骤符合制造商的指示。Dexamethasone-Induced蛋白质的测定(用作地塞米松水平指数),都使用MyBioSource®酶联免疫试剂盒根据制造商的指示。

光密度(OD)为所有化验测定波长450 nm纠正在540 nm标(Biotek协同HT微型板块读者,Biotek仪器公司。美国佛蒙特州)。

统计分析

数据分析学生的学习任务使用之间的区别意味着两个治疗和假定值≤0.05报告意义重大。之间的细胞因子和皮质类固醇治疗,治疗,对照组用单向方差分析进行了分析(方差分析)。假定值≤0.05采用的重要。寄生负载和糖皮质激素和细胞因子之间的关系和数量的突变等位基因之间的相关性和糖皮质激素和细胞因子进行了分析,相关系数和R2-value决心展示积极或消极的相关性。

图1

治疗寄生虫的作用荷载和抗疟药物耐药基因多态性频率malaria-positive样本人口表示。平均寄生负载,由显微镜和qPCR之间(A)中描述病人治疗(n = 12,对待以前ACT)和未经处理的(n = 14,从不治疗疟疾这一集)(p≤0.581)。处理和未经处理的病人的比例表现出至少一个突变等位基因K13,Pfcrt(CRT),或Pfmdr1(MDR)基因(B)。描述了突变等位基因的平均数量在上面的基因检测到每个病人mutation-positive处理和未经处理的患者样本中描述(C)(p≤0.342)。每个观察突变等位基因的流行在所有malaria-positive病人(D)描述了。

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20180929112330845

结果

行为治疗寄生虫血症的影响

为了确定行为治疗综合症是由寄生虫病人的活动,我们最初的状态评估的恶性疟原虫malaria-positive样本,通过测量血液中的疟原虫负载(寄生虫血症)。实验比较的结果的平均数寄生虫/µL未经治疗的患者(图处理1)表明加强寄生虫血症治疗的患者(p≤0.581),可由干扰免疫反应影响il - 10,白介素,TGF-β(见讨论)。

行为治疗的效果的发病和频率寄生虫遗传多态性

因为后处理持久性血液中的疟原虫的寄生虫通常归因于抗疟药物耐药基因多态性(11,18),我们还研究了在K13多态性的频率,Pfcrt(CRT)和Pfmdr1(MDR)基因,与对抗疟药物的耐药性,在疟原虫阳性样品从我们的研究人群。此外,我们检查的模式表达这些多态性与治疗。恶性疟原虫突变体,在这项研究中定义为包含至少一个单核苷酸多态性(SNP)在上面的基因,与野生型相比恶性疟原虫,在这项研究中定义为缺乏上述基因的突变。图1B代表处理和未经处理的患者样本的百分比,它包含突变恶性疟原虫。有一个更高比例的突变体恶性疟原虫在治疗患者未经治疗的患者相比,支持药物压力突变的假说。值得注意的是,我们的研究揭示了高度的百分比K13和治疗MDR突变患者治疗(ACT),符合相关报道青蒿素和lumefantrine K13 MDR-mediated阻力,分别为(10,22]。总共57.7%的疟疾阳性患者样本(包括处理和未经处理的)表现出至少一个基因的SNP在这项研究中,然而,一些患者表现出多个SNP。

为了确定药物的作用压力snp的数量,处理和未经处理的突变患者恶性疟原虫分析snp的平均数量。图1C描绘了一个更多的snp每个病人的治疗患者未经治疗的患者相比,表明治疗不仅与突变患病率增加有关疟原虫的人口,但也增加了数量的突变。特定的突变等位基因的流行程度在所有malaria-positive病人如图1D,最普遍的等位基因是K13 - K189T等位基因和MDR Y184F等位基因。我们的研究结果显示,多数高的耐药基因多态性,这不是反光的已知最后康复临床疟疾。

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