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一篇治疗白血病的医学硕士毕业论文

本站原创   发布时间:2018-11-23   [点击量:512]  


摘 要

目的:为寻找白血病治疗有益的新药物,并为以后的进一步研究提供理论依据。考察白芍总苷脂质体对于 K562、HL-60以及人新鲜骨髓白血病细胞的抑制效果,观察白芍总苷脂质体诱导 K562、HL-60以及人新鲜骨髓白血病细胞的凋亡形态学变化,并从形态学、基因、蛋白表达各方面研究白芍总苷脂质体诱导HL-60 的各种改变,验证凋亡发生过程,并对细胞凋亡的途径,做出初步推断。方法:该研究以对数期生长的 K562、HL60 细胞建立白芍总苷脂质体诱导细胞凋亡的模型,采用淋巴细胞分离方法提取白血病病人新鲜骨髓中的白血病细胞,并使用CCK8 方法检测细胞增殖情况。采用方差分析,研究白芍总苷脂质体浓度、培养时间以及白血病细胞种类三因素下,白血病细胞抑制率的变化。使用200ug/ml白芍总脂质体培养HL60,并对空白对照组与6h、12h处理组镜检观察其形态学变化。分别使用RT-PCR与Western Blot方法,鉴定白芍总苷脂质体对于内源性细胞凋亡因子Bcl-2、Bax、Caspase3和Caspase9的基因与蛋白质表达水平的变化。 结果:(1)白芍总苷脂质体对K562、HL60和人新鲜骨髓白血病细胞表现出随着培养时间的增加,抑制率不断的上升(R=0.797,P=0.000<0.01);随着白芍总苷脂质体浓度的上升,抑制率亦不断上升(R=0.196,P=0.013<0.05)。通过三因子方差分析表明,白芍总苷脂质体浓度、白血病干细胞种类、培养时间均对抑制率表现出极显著效应,其中白芍总苷脂质体浓度的F值表现最大,达到了1629.132。(2)在细胞形态学上观察12h之后的细胞可以发现,HL60细胞已经明显的表现出固缩、边集、碎裂等典型的凋亡细胞核形态特征,细胞核的形态上不规则程度也在不断的加大。使用流式细胞仪观察其凋亡率,结果表明:K562细胞凋亡率由3.0%极显著上升至42.49%(X2=74.526,P=0.000<0.01);HL60由3.87%极显著上升至46.73%(X2=71.331,P=0.000<0.01);人新鲜骨髓白血病干细胞由4.15%极显著上升至52.46%(X2=81.800,P=0.000<0.01),均具有统计学意义。(3)在mRNA的表达水平上,随着培养时间的增加,Bcl-2的表达水平显著下降(R=-0.880,P=0.000<0.01)、Bax则显著上升(R=0.825,P=0.000<0.01)、Bcl-2/Bax比值显著下降(-0.957,P=0.000<0.01);Caspase3(0.676,P=0.008<0.01)和Caspase9(0.606,P=0.018<0.05)表现出明显的上升趋势。在蛋白质的表达水平上,同样表现出Bcl-2的表达水平不断下降(-0.899,P=0.000<0.01)、Bax(0.695,P=0.005<0.01)、Caspase3(0.807,P=0.001<0.01)和Caspase9(0.597,P=0.020>0.05)则不断上升;在Bcl-2/Bax比值之上,表现出不断下降趋势(-0.757,P=0.002<0.01)。这一结果与一般的内源性细胞凋亡结论一致。结论:白芍总苷脂质体对K562、HL60和人新鲜骨髓白血病细胞具有良好抑制效果,并且伴随着良好的时间依赖性和剂量依赖性。随着培养时间延长,白血病细胞凋亡形态变化而越明显。分子机理研究表明白芍总苷脂质体能够通过内源性凋亡机制,从而达到促进白血病细胞凋亡的目的。该研究认为白芍总苷脂质体能成为临床中一种优良的白血病治疗药物。


关键词:白芍总苷脂质体;白血病;细胞凋亡。


 言  

白血病是一种由于骨髓干细胞的恶性克隆性疾病,是临床中常见性血液系统恶性肿瘤之一[1-2]。近些年来的白血病发病率居高不下,据相关报告显示[3-4],2004-2005年我国城乡居民白血病患病率约为3.82/10万,在恶性肿瘤死亡率顺位中位居第6。2014年,我国儿童恶性肿瘤的发病率呈连续上升的趋势,14岁以下儿童的死亡原因中,恶性肿瘤已经排名第二位[5-7]。在所有肿瘤之中,白血病、脑肿瘤、恶性淋巴瘤与神经母细胞瘤发病率占据前四,其中仅仅白血病就占1/3[3]。可见,白血病业已成为严重影响我国城乡生命安全和居民健康的疾病之一。

白血病发病现象是在多种致癌因子作用之下,骨髓造血干细胞的遗传物质发生变异,导致正常的造血干细胞转变为白血病干细胞,获得了异常的自我分裂能力,从而使未成熟骨髓细胞分化过程出现障碍[8-9]。白血病可分为急性白血病和慢性白血病两种,急性白血病又可分为急性髓系白血病(AML)和急性淋巴细胞白血病(ALL)[10-12 ]。世界卫生组织将 AML分为4类:伴重现性染色体异常的AML、伴多系增生异常的 AML、治疗相关的AML 以及骨髓异常增生综合征(MDS)、不另分类的AML 等[ 13-15] 。根据其染色体核型与预后的关系,白血病又可分为为低危、中危、高危 3 类 [15-16]。

目前,白血病治疗仍以联合化疗为主,但其医治效果有限且负面效应较大。中危组白血病患者预后较差,缓解后骨髓移植复发风险较高[17]。高危组预后极差,缓解后在短时间内容易复发并表现出耐药,病情恶化,异基因骨髓移植效果差。同时,有些药物作用靶点的特异性较差,无法准确特异性的识别区分正常体细胞与肿瘤细胞的区别。这样,在抑制、杀死或者诱导肿瘤细胞凋亡的过程中,往往会造成正常组织细胞明显的抑制、损害甚至死亡,导致整个人体产生一些毒副作用,严重者可因出血、感染、脏器衰竭等毒副作用致死。长期化疗会对患者各个生理系统造成严重的损害,使患者最终无法继续耐受化疗。或者,因白血病干细胞变异,产生耐药性而最终导致治疗失败。即使在理想条件下,有合适供体、经化疗后能够完全缓解、患者病情得到控制、无严重感染,可进行造血干细胞移植术。但是,其移植费用昂贵,HLA 配型完全相合几率低,干细胞供体来源少,不能广泛应用。而且,异基因造血干细胞移植后为防止排异反应以及移植物抗宿主病的发生需长期服用类固醇等免疫抑制剂[18]。总之,上述治疗方案具有很大的局限性。所以,白血病的治疗更需要一种高效、低毒、经济的治疗手段。  

白芍是毛莨科植物芍药 (paeonia lactiflora Pall) 的干燥根[19-20],是一种传统的中药。其中芍药苷是白芍总苷脂质体中含量最高的成分,占总甙的比例达 90% 以上[21]。现代药理研究表明,白芍总苷脂质体具有抗肿瘤的[22]作用。王世宏等[22-23]研究发现,体外培养实验表明能抑制 SMMC-7721、HepG2 肝癌细胞的增殖,并诱导病变细胞凋亡。覃雪峰等[24-25、27]通过白芍总苷脂质体对多种肿瘤细胞体外实验研究结果表明,其能明显抑制白血病细胞 K562细胞的增殖,并且表现出良好的剂量依赖效应。 

    细胞凋亡是细胞在外界环境信息分子或自身因子的刺激下,细胞出现的自主性质的程序性的死亡过程[28-29],凋亡过程对于维持机体内环境的稳态和正常的生理技能都是十分必要[30-31]。现在研究发现[32],细胞凋亡异常与肿瘤的发生关系非常紧密。多数肿瘤细胞的发生常伴有抗凋亡基因的过度激活、异常表达以及促凋亡基因缺失以及失活,这是各类肿瘤疾病发生过程中常见的细胞遗传水平上的变化,例如Bcl-2 基因为重要的抗凋亡基因,当 Bcl-2基因突变表达增高时,正常细胞的抗凋亡能力增强,通过抑制凋亡相关基因的表达,最终诱发肿瘤[33-34]。细胞凋亡的途径一般分为内源性途径(线粒体/细胞色素 C 通路)和外源性途径(死亡受体通路)[35]。其中,Caspase家族在凋亡过程中,主要作用有启动、促进、执行凋亡过程,同时参与内源性与外源性凋亡通路 [ 36-37]。现在大量研究证明[38-39],这些参与细胞凋亡过程调节的信号分子,可作为有效的抗癌药物作用靶点,通过诱导肿瘤细胞的凋亡发挥抗肿瘤作用。

     因此,本研究在上述背景的基础上,选取K562、HL-60(人早幼粒细胞白血病细胞株)和人新鲜骨髓白血病干细胞为研究对象,考察白芍总苷脂质体对于 K562、HL-60以及人新鲜骨髓白血病干细胞的抑制效果,观察白芍总苷脂质体诱导 K562、HL-60以及人新鲜骨髓白血病干细胞的凋亡发生状况。并从形态学、基因、蛋白表达各方面白芍总苷脂质体诱导 HL-60 的各种改变,验证凋亡发生过程,并对细胞凋亡的的途径,做出初步推断。旨在发现对白血病治疗有益的新药物,并为以后的进一步研究提供理论依据。

实验材料与方法

1 实验仪器与试剂

1.1  主要材料

⑴白血病干细胞类别

K562(慢性髓细胞性白血病细胞株)、HL60(人急性早幼粒细胞白血病细胞株)购买于上海拜力生物科技公司。白血病新鲜骨髓液取自泸州市人民医院血液科,选取初治、骨髓中幼稚细胞比例占 80%以上的白血病病人。对淋巴细胞细胞悬液进行分离,分离并提取骨髓中单个核细胞,其中多数为白血病细胞,用于实验。

⑵培养液和血清

RPMI-1640为袋装粉末状产品,购自 GIBCO 公司。每袋 RPMI-1640 以 1L 双蒸馏水配制,加入 10%新生胎牛血清、1%双抗、1%谷氨酰胺,搅拌均匀,配制成细胞培养液,经高压滤器过滤除菌后,放于4℃中恒温保存。新生胎牛血清(100ml/瓶)产自HyClone 公司。

⑶抗生素

青霉素、链霉素以 1:1 比例,用0.9%生理盐水配制成 10000 U/ml 溶液,放置于-20℃的恒温冰箱中,使用时使用常温融化。

⑷细胞冻存液

用新生胎牛血清与 DMSO,按照9:1的比例混合均匀配制,要求现用现配。

⑸白芍总苷脂质体

广州中医药大学赠送,用DMSO 配制成 100mmol/L 浓度的药液,常温条件下避光保存。使用时根据目标浓度,以 RPMI-1640 培养液稀释,稀释搅拌成乳状物后使用。由于白芍总苷脂质体在 RPMI-1640 培养液中比较容易聚集沉淀,稀释液要现配现用。

⑹磷酸盐缓冲液(PBS)

在 800ml去离子水中溶解NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HP041.15g、KH2PO40.2g,加蒸馏水定溶至1 L。再将其高压灭菌后,4℃恒恒温保存。

⑺Tris 盐缓冲液(TBST)

用 600ml 蒸馏水溶解 6g NaCl和 2.2g Tris-base,加入 HCl 将PH值调至7.6,加入去离子水定容至1L,加入Tween-20 1ml,混匀。高压灭菌后室温保存。

⑻10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液

取Tris粉末30g、甘氨酸144g、SDS 10g,加去离子水搅拌至完全溶解,并定容至1L,高压灭菌后室温保存。使用时,用去离子水稀释成10×电泳缓冲液,反复使用2-3 次。

⑼5 × SDS-PAGE Loading Buffer 蛋白上样缓冲液

量取1M Tris-HCl(pH 6.8)0.7ml;25%的甘油10ml;5%的 SDS 溶液 4ml;1%的溴酚兰1ml;加入去离子水充分混匀,并定容至10ml;4℃恒温保存。

⑽转膜缓冲液

称量 Glycine 12.4g 、Tris 3.01g、SDS 0.8g ,加入 700 ml 去离子水,充分溶解后加入甲醇200 ml,最后定容至 1L 室温保存,溶液可重复使用 2-3 次。

⑾封闭液

称量5g 脱脂奶粉,加入 100 ml TBST 充分溶解后,置于-20℃恒温保存。使用时室温下解冻。

⑿实验所用试剂

流式 AnnexinⅤ/PI 凋亡试剂盒购于晶美生物公司。Hoechst 染液为从山东省医学科学院基础所免疫实验室购买所得。淋巴细胞分离液购于天津灏洋生物制品公司。CCK8 染色剂购于Sigma 公司,以 PBS 溶液配成 5mg/ml 浓度稀释液,过滤后,4℃避光保存。

Western blot 试剂中RIPA 裂解液、PMSF 显色液 A 和 B 购于碧云天公司;PVDF膜购于Millipore 公司,30%丙烯酰胺、10%SDS、10%过硫酸铵(APS),TEMED 购于Sigma 公司,Prestained Protein Ladder 购于北京博凌科为生物科技有限公司、Caspase3、Caspase 9蛋白一抗购于 Cell Signaling 公司,辣根过氧化物酶标记的鼠二抗、兔二抗购于 abcam 公司;一抗二抗去除液购于 Sigma 公司。

RT-PCR 试剂中氯仿、乙醇、异丙醇购于国药集团化学试剂有限公司;Trizol、Rnasin、MMLV、DL2000 Marker 购于 invitrogen 公司; Oligo(dT)18、5×RT buffer、4×10mmol/L dNTP 购于 fermentas 公司;2×power taq PCR mastermix、DEPC 水购自 Sigma,Bcl-2、Bax、Caspase 3、Caspase 9 引物由上海博尚生物技术有限公司合成。

1.2 主要仪器设备

⑴酶标仪Mk3(上海赛默生物科技发展有限公司)

⑵台式高速冷冻离心机3k15(上海珂淮仪器有限公司)

⑶超净工作台(苏净安泰公司)

⑷低速常温离心机 TD5M(长沙湘智离心机公司)

⑸CO2恒温细胞培养箱 WJ-6C(日本 HIRASAWA 公司)

⑹倒置显微镜 XDS-1B (重庆光电仪器公司)

⑺荧光显微镜 IX71-F22FL/PH (日本奥林巴斯 OLYMPΜS 公司)

⑻立式压力蒸汽灭菌器 LDEX-50KBS(上海中宏医疗器械厂)

⑼紫外分光光度 ND-1000(美国 NanoDrop)

⑽凝胶成像分析仪(Cell Bio Sciences 公司)

⑾流式细胞仪 COMLTER EPICS XL(美国 BECKMAN 公司)

⑿温度梯 PCR 扩增仪 5638R1410(美国 BIO-RAD 公司)

⒀PCR 扩增仪 icycle 580BR12509(美国 BIO-RAD 公司)

⒁荧光倒置显微镜(日本尼康公司)

⒂LAS-4000 Mini 化学发光仪(日本 FΜJIFILM 公司)

⒃稳压稳流电泳仪 (美国 BIO-RAD)

⒄XS 105DΜ 电子分析天平(Thermo Fisher)

⒅TS-1 脱色摇床(海门其林贝尔)

⒆制冰机 SIM-F140AY65(日本 Sanyo Electric 公司)

(全文略)

文章标题:《一篇治疗白血病的医学硕士毕业论文》,原文地址:,如有转载请标明出处,谢谢。

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