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姜黄素对黑色素瘤B16-F10细胞增殖及线粒体凋亡影响的机制研究

   发布时间:2017-11-22   [点击量:397]  


摘 要 目的:探讨姜黄素体外抗黑色素瘤的药效及作用机制,为姜黄素抗肿瘤的药理机制提供实验依据。方法:以黑色素瘤B16-F10细胞为实验材料,在离体水平研究姜黄素对细胞活力、细胞内活性氧水平、细胞凋亡的影响[1]。结果:姜黄素能显著抑制B16-F10细胞增殖、促进其凋亡;姜黄素可促进B16-F10细胞活性氧水平增高,且显著提高细胞内Caspase-4,9蛋白的表达,可能通过启动线粒体凋亡途径发挥促癌细胞凋亡生物活性。结论:姜黄素对黑色素瘤具有显著抑制作用[2],其可能的机制是通过提高细胞内活性氧水平,启动线粒体凋亡途径而发挥促黑色素瘤细胞凋亡的作用。

  关键词 姜黄素 黑色素瘤 B16-F10细胞株 线粒体凋亡

  黑色素瘤是由异常黑素细胞过度增生引发的常见的皮肤肿瘤,其特点是恶性程度高、进展快、死亡率高[3]。临床恶性黑色素瘤的治疗常采用手术结合联合化疗方案[4]。本研究以黑色素瘤细胞株B16-F10为实验材料,观察姜黄素体外抑瘤作用。同时,以活性氧激活线粒体凋亡途径为切入点,探讨姜黄素抗黑色素瘤的可能分子机制[5],进而推断姜黄素的分子药理学作用。

  材料与方法

  材料:姜黄素(纯度≥98%);RPMI1640、胎牛血清、HEPES、EGTA、BSA、DMSO等;MTT;DCFH-DA活性氧探针;线粒体提取试剂盒;Caspase-9(p-35,sc-8355)兔抗小鼠多克隆抗体;Caspase-4(ab-25898)兔抗小鼠多克隆抗体;TUNEL细胞凋亡检测试剂盒;常规生化试剂;B16-F10小鼠皮肤黑色素瘤细胞株。

  方法:①细胞培养:B16-F10细胞常规培养,每3天传代一次,实验时取对数生长期细胞,用0.25%Trypsin-EDTA液消化后,用培养基制成细胞悬液。②细胞生长活力测定:细胞于96孔板培养24、36、72小时;向待检测的细胞培养板中加入MTT溶液(每孔20μl),于CO2培养箱中孵育4小时;吸出培养板中的液体,加入100μl DMSO溶液,置于振荡器混匀10分钟,酶标仪在450nm波长下测OD值;采集数据,依照下列公式计算细胞生长抑制率:(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。③DCFH-DA活性氧检测:实验方法依照试剂盒说明进行,采用激光共聚焦显微镜观察,530nm发射波长附近激发为绿色。④细胞涂片TUNEL染色、荧光显微镜观察:细胞接种于6孔板(3ml/孔),细胞接种密度4×105 cells/ml,被试药物干预24、48小时后收集细胞、预冷的0.1M PBS洗3次,用细胞离心涂片机将细胞甩到多聚赖氨酸包被的载玻片上;4%多聚甲醛固定30分钟、风干;1% Triton X-100 PBS透膜;加入TdT酶、荧光标记液及TUNEL检测液、孵育60分钟;抗荧光淬灭液封片、荧光显微镜观察、摄片。⑤细胞涂片Caspase-4,9抗体免疫组织化学显色、光镜观察:细胞接种于6孔板(3ml/孔),细胞接种密度4×105 cells/ml,被试药物干预24、48小时后收集细胞、预冷的0.1M PBS洗3次,用细胞离心涂片机将细胞甩到多聚赖氨酸包被的载玻片上;4%多聚甲醛固定、风干;1%Triton X-100 PBS透膜;正常动物血清封闭抗原;加一定稀释度的Caspase-4,9一抗(50μl/片),4℃湿盒孵育、过夜;加入通用型2抗PV-6001;AEC显色(红色)、光镜观察、摄片。

  统计学处理:定量数据采用SPSS11.0软件包进行统计学分析,结果以X±S表示,组间比较采用单因素方差分析,t检验,P<0.05表示差异有统计学意义。

  结 果

  姜黄素对B16-F10细胞生长抑制率的影响:用12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml四个浓度姜黄素孵育B16-F10细胞24、48和72小时,倒置显微镜下可观察到随着药物作用时间的增加B16-F10细胞形态学的变化:细胞变圆、体积缩小、悬浮细胞(脱落)显著增多。MTT法检测,数据换算、统计分析结果表明姜黄素对B16-F10细胞的生长抑制存在时间和剂量的依赖性。

  姜黄素对B16-F10细胞氧化损伤:依照前期实验的结果,本实验选择50μg/ml的给药剂量作用体外培养的B16-F10细胞。分别在孵育24、48小时采集细胞,采用DCFH-DA活性氧检测试剂盒,在激光共聚焦显微镜下观察姜黄素对B16-F10细胞活性氧水平的影响。结果表明姜黄素孵育48小时,能显著增高B16-F10细胞内活性氧水平,引起细胞形态改变。与对照组比较,姜黄素孵育48小时,B16-F10细胞内活性氧自由基水平显著增高(P<0.01)。

  姜黄素对B16-F10细胞凋亡的影响:一步法TUNEL染色,荧光显微镜观察,绿色荧光示凋亡细胞。实验结果表明姜黄素作用24小时可诱导少量B16-F10细胞凋亡,作用48小时可诱导大量B16-F10细胞凋亡,图像分析结果显示与空白对照组比较,姜黄素作用48小时B16-F10凋亡细胞显著增多(P<001)。

  姜黄素对B16-F10细胞线粒体凋亡相关蛋白Caspase-4,9的影响:已知Caspase-9是诱发线粒体凋亡过程的关键蛋白,位于细胞的胞浆内;而Caspase-4同样是诱发细胞凋亡的起始因子,位于内质网膜上,二者共同介导氧化应激作用诱导的线粒体凋亡过程。依照前期实验的数据,本实验选择50μg/ml的给药剂量作用体外培养的B16-F10细胞。分别在孵育24、48小时采集细胞,用离心法制备细胞涂片,行常规免疫组织化学染色,测定姜黄素对B16-F10细胞Caspase-4,9表达的影响,结果表明姜黄素干预B16-F10细胞,可显著上调细胞内Caspase-4,9水平。

  讨 论

  姜黄素通过诱导细胞凋亡发挥体外抗肿瘤作用:本实验观察到,姜黄素能够显著抑制黑色素瘤B16-F10细胞生长,且呈剂量和时间依赖性。该结果与桂飞等[6]的研究结果一致。细胞凋亡实验结果表明,姜黄素具有诱导肿瘤细胞凋亡的生物活性,作用B16-F10细胞48小时可探测到大量的凋亡细胞;与线粒体凋亡相关因子caspase-4,9检测结果表明,姜黄素作用B16-F10细胞48小时能显著升高细胞内caspase-4,9的水平。该实验结果初步提示姜黄素不仅直接杀伤肿瘤细胞,而且能通过诱导细胞凋亡表现为显著的抑瘤活性。

  生命体受到各种有害刺激时,体内活性氧自由基(ROS)呈增多的趋势,称氧化应激[7]。已有研究发现,ROS是多种药物诱导细胞凋亡过程中的一个重要信号分子,与肿瘤形成、肿瘤治疗密切相关。本研究发现,姜黄素可诱导B16-F10细胞内ROS水平的迅速增高,初步提示姜黄素可能通过诱导肿瘤细胞产生ROS,提示姜黄素诱导细胞凋亡可能通过启动线粒体凋亡过程而实现。

  参考文献

  1 中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京:化学工业出版社,2010:218.

  2 Fantin VR,Leder P.Mitochondriotoxic compounds for cancer therapy[J].Oncogene,2006,25(34):4787-4797.

  3 许祖德.病理学[M].上海:复旦大学出版社,2003.

  4 Blasiak J,Trzeciak A,Malecka-Panas E,et al.DNA damage and repair in human lymPhoeytes and gastric mucosa cells exposed to chromium and curcumin[J].Teratog Carcinog Mutagen,1999,19:19-31.

  5 Kelly MR,Xu J,Alexander KE,et al.Disparate effects of similar phenolic phyto chemicals as inhibitors of oxidative damage to cellular DNA[J].Mutat Res,2001,485:309-318.

  6 桂飞,马伟峰,蔡绍晖,等.姜黄素抗小鼠黑色素瘤分子机制的初步研究[J].中药材,2008,31(11):1685-1689.

  7 Fantin VR,Leder P.Mitochondriotoxic compounds for cancer therapy[J].Oncogene,2006,25(34):4787-4797.

文章标题:《姜黄素对黑色素瘤B16-F10细胞增殖及线粒体凋亡影响的机制研究》,原文地址:,如有转载请标明出处,谢谢。

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