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滇丹参中丹酚酸B提取及纯化工艺研究

   发布时间:2017-12-11   [点击量:400]  


摘 要:目的:优选滇丹参提取及絮凝沉降法纯化丹酚酸B的最佳工艺。方法:以滇丹参主要成分丹酚酸B含量为评价指标,采用正交试验优选提取及纯化的最佳条件。结果:滇丹参的最佳提取条件为8倍量水,煎煮2次,每次1 h;采用ZTC11+1为絮凝沉降剂,药液浓度在1 g/5 mL,絮凝剂的用量是B∶A=4∶2,搅拌速度为100 r/min时,得到的精制液中丹酚酸B含量最高。结论:使用絮凝澄清的方法精制水提液,用量少,污染小,丹酚酸B的含量损失较少。
  关键词:滇丹参;丹酚酸B;ZTC1+1型絮凝剂

  滇丹参为唇形科鼠尾草属植物云南鼠尾草(salvia yunnanensis C.H.Wright)的干燥根及根茎,味微苦,性微寒。具有调经、活血、散瘀、镇静止痛之功,用于月经不调、风湿痹痛、子宫出血、吐血等症[1]。现代药理作用研究表明,滇丹参具有增加冠状动脉血流量,防止血栓形成,抑制血小板聚集,降低血黏度,消除自由基,改善血管内皮功能,抑制血管损伤后的内膜增生等功能,在防治冠心病及防治血管成形术后血管再狭窄中均有重要作用[2]。滇丹参主要含有脂溶性的丹参酮及水溶性的酚酸类成分,水溶性成分中丹酚酸B的含量较高,为3分子丹酚素与1分子咖啡酸缩合而成。丹酚酸B活性强,具有强烈的清除自由基和抗氧化作用。本文以丹酚酸B的含量为评价指标,对滇丹参的提取工艺及絮凝澄清纯化工艺进行研究。
  1 仪器与试药
  1.1 仪器 Waters e2695型高效液相色谱仪(美国);FB124型电子分析天平(上海舜字恒平科学仪器有限公司);SK250HP型超声提取器(上海科学仪器有限公司)。
  1.2 试药 丹酚酸B对照品(中国药品生物制品检定所,批号:111562-200302);滇丹参(购于云南绿生药业有限公司);ZTC1+1天然澄清剂(购于天津正天成澄清技术有限公司);乙腈、甲醇为色谱纯;水为去离子水;其它试剂均为分析纯。
  2 方法与结果
  2.1 丹酚酸B含量测定
  2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取丹酚酸B对照品适量,加75%甲醇制成每1 mL含0.192 mg的溶液,即得。色谱条件:Agilent-C18色谱柱(Φ4.6 mm×250 mm,5 μm);甲醇-乙腈-甲酸-水体积比(26∶9∶1∶64)为流动相;柱温:35 ℃;检测波长:286 nm;流速:0.8 mL/min;理论塔板数按丹酚酸B计不低于2000。
  2.1.2 线性关系的考察 分别精密吸取丹酚酸B对照品溶液4、6、8、10、12、14μL,在上述色谱条件下依次进样测定。以峰面积积分值为纵坐标,对照品的进样量为横坐标进行线性回归,得到回归方程为Y=895054x-68669,相关系数r=0.9999。结果表明丹酚酸B进样量在0.768~2.688 μg范围内与峰面积呈现良好线性关系。
  2.1.3 样品测定 精密吸取对照品溶液及供试品溶液各10 μL进样,以外标法计算含量。
  2.2 提取工艺研究
  2.2.1 提取溶剂的选择 分别称取40 g(准确到0.01 g)药材4份,分别以水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇为溶剂,加入8倍量溶剂提取1.5 h,过滤,滤渣再用6倍量溶剂提取1 h,合并滤液,浓缩并定容到500 mL,用微孔滤膜(0.45 μm)过滤,精密吸取10 μL溶液,注入液相色谱仪,测定丹酚酸B的含量,结果分别为2.18%、2.45%、2.37%、2.09%。表明30%乙醇提取含量最高,但以水为溶剂时,与30%乙醇提取率相差不大,因考虑实际生产的需要,故以水为提取溶剂。
  2.2.2 水提工艺正交实验设计
  2.2.2.1 设计方案 以加水量、提取时间、提取次数为考察因素,以丹酚酸B含量为评价指标,每个因素选取3个水平,采用正交表L9(34)安排试验,因素水平表见表1。
  2.2.2.2 实验方法 称取药材9份,每份20 g,按照正交实验表进行试验,滤液浓缩并定容到500 mL,用微孔滤膜(0.45 μm)过滤,精密吸取溶液10 μL,注入液相色谱仪,测定。
  2.2.2.3 实验结果 结果见表2。根据直观分析结果表明,紫丹参的最佳水提工艺为8倍量水,提取3次,每次1 h,即A2B1C3 。由于提取3次和2次的结果相差不大,为了节约成本,将工艺定为8倍量水,提取2次,每次1 h,即A2B1C2
  2.3 絮凝澄清纯化工艺研究
  2.3.1 ZTC1+1澄清剂溶液的配制 ①A组分溶液的配制 称取ZTC1+1Ⅲ澄清剂A组分1 g,先用少量蒸馏水搅成糊状,然后加蒸馏水至100mL,溶胀24 h,搅匀,双层纱布滤过,即得1 %A 组分黏胶液;②B组分溶液的配制 称取ZTC1+1Ⅲ澄清剂B组分1 g,用少量1 %醋酸溶液溶解并搅成糊状,然后加1 %醋酸至100 mL,溶胀24 h,搅匀,双层纱布滤过,即得1 %B 组分黏胶液。
  2.3.2 设计方案 经过预实验,发现丹酚酸B在60 ℃时絮凝效果较好,故以60 ℃为絮凝温度,采用正交试验对絮凝澄清工艺的主要工艺参数进行优化。选择药液浓度、ZTC1+1絮凝剂加入量、搅拌速度3个主要影响因素进行考察,以丹酚酸B含量作为评价指标,用L9(34)正交表安排试验方案,因素水平设计见表3。
  2.3.3 实验方法 按上述最佳提取工艺提取药材,按正交试验设计浓缩至不同浓度,分别量取9份浓缩药液,每份50 mL,在60℃时,加入4 mL的1%B组分溶液用相应的旋转速度搅拌15 min,保温1 h,搅拌3 min,然后每隔30 min左右搅拌3 min;1 h后,于60 ℃温度恒温搅拌下,分别加入1%A组分黏胶液搅拌3 min,保温15 min,离心过滤,精密量取1 mL定容至100 mL,用0.45 μm的微孔滤膜滤过,测定丹酚酸B含量。
  2.3.4 实验结果 结果见表4~表5。由直观分析可知,影响絮凝澄清的因素顺序为:药液浓缩比>絮凝剂组分比>搅拌速度,最佳工艺组合为A1B1C2。方差分析显示,药液浓度对精制工艺具有显著性影响。
  2.3.5 验证试验 平行取相同量的药液3份,每份50 mL。按上述确定的最佳工艺条件进行验证。同时测得丹酚酸B含量分别为35.62、35.85、35.77 mg/g,验证结果与正交试验相符。
  3 讨论
  由于丹酚酸B在水提液中不稳定,提取时间长及温度过高均会导致丹酚酸B的含量下降,因此,在实验过程中需注意丹酚酸B的降解问题。
  纯化工艺研究结果表明,药液浓缩比为1:5(g/mL)时,丹酚酸B保留率最高,且随药液越稀,丹酚酸B的含量越低。絮凝剂组分比随着A组分的增加,丹酚酸B的含量随之降低,所以较佳的絮凝剂组分比例在4/2(B/A)时,效果最好。
  ZTC1+ 1Ⅲ型絮凝澄清剂选择性地与溶液中的胶质、蛋白质、鞣质络合而共沉,具有安全无毒、使用简便、不影响有效成分等特点,相对于水提醇沉工艺使用乙醇而言具有提高目标含量,减少生产周期,减少成本,且制备的干膏吸湿性低等优点。
  
  参考文献:
  [1]钱子刚.滇丹参药用植物源[J].中药材,2002,25(9):628.
  [2]罗庆祎.滇丹参对冠心病的防治作用[J].临床误诊误治,2007,20(5):23.

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