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肺炎支原体的分离培养与临床检测综述

   发布时间:2017-12-19   [点击量:427]  


1、肺炎支原体的别离与培育

培育法是检测病原体存在的直接依据,是检测肺炎支原体的金规范。可分为一般的固体培育法和快速培育法。

1. 1、固体培育法 肺炎支原体对培育基的养分要求较高,除根底养分物质外,培育基中需参加 10% ~20% 的人或动物血清,以供给胆固醇和长链脂肪酸,并可安稳细胞膜。初度别离培育时需添加 10% 的酵母浸膏,并供给 5%CO2,最适 pH 值为 7. 6 ~8. 0,低于 7. 0 时将导致其逝世。最适温度为 36 ~ 37 ℃,支原体成长缓慢,在 1. 4% 血琼脂培育基上培育 3 ~10 d 可构成 “油煎蛋样” 菌落。菌落在低倍镜下调查核心区较厚呈圆形,好像蛋黄伸入培育基中,周围薄薄一层颗粒区,形同蛋清,菌落一起能吸附豚鼠红细胞并能发作溶血素,呈现溶血环。在试验室培育中呈现即可确诊为肺炎支原体[6]。

培育法是检测肺炎支原体的金规范,一旦检出,即可确诊。但其缺点在于需求的时刻长,一般培育需2 周左右,成长条件严苛,当标本中 MP 数量少、培育基养分规范不行或操作办法不其时,就会呈现假阴性成果; 而且呼吸道存在较多的杂菌,阳性率低,直接影响临床的快速确诊,使患者得不到及时有用的医治。现在仅在科研单位进行科研活动,临床一般不选用。

1.2、快速液体培育法 近年来,跟着微生物确诊技能的快速展开,现已呈现 48 ~ 72 h,乃至 24 ~ 48 h即可出成果的肺炎支原体培育试剂盒,并可一起做药敏试验,这在必定程度上弥补了传统培育时刻慢的缺点。咽部分泌物、支气管分泌物、痰液等都可作为标本进行 MP 的培育,该办法对试验室的要求不高,可明显缩短 MP 培育法的检测时刻,而且防止了抽血构成的苦楚,特别适用于年纪较小的儿童。

该办法的原理是肺炎支原体在成长过程中发酵葡萄糖产酸,使培育基中酸碱指示剂发作色彩改变来作为肺炎支原体成长的指征,而且在培育的一起进行药敏试验,可大大缩短检测的时刻。标本中其他支原体和细菌则因培育基中加人了青霉素、醋酸陀和生物抑菌剂而被按捺[7]然后确保该办法的特异性[8],但当样本中有分化葡萄糖的非意图菌对培育基中的抑菌剂无效时可能构成假阳性成果[9],影响到确诊的精确性[10]。假如患者检测前现已服用对 MP 灵敏的药物会导致检出率下降。据谢国艳等[11]报导,这种办法检测 MP 的假阳性率较高,细菌和真菌的培育阳性率已到达了 7. 9%,因而有必要在培育 48 h 作第一次断定成果后转种进一步做一般细菌培育,再一次对培育成果作剖析后才干做出精确判别。一起,从试验成果看出,引起 MP 培育假阳性的标本中真菌所占份额最大 ( 首要为念珠菌) ,已到达 71. 1%,阐明真菌感染时 MP 的培育阳性率会大幅度前进,这可能与念珠菌在呼吸道疾病中多见而 MP 培育又多取材于呼吸道有关,故此项检测办法有必定的局限性。

别的在调查药敏成果时,致病病原体所造成的的假阳性可在必定程度上反映该病原体对抗生素的灵敏程度,药敏成果可供给必定的临床价值,但对错致病菌所造成的的假阳性就有可能误导临床用药医治。

2、肺炎支原体的免疫学检测

2. 1、肺炎支原体抗原检测

2. 1. 1、选用不同株 MP 单抗,用双抗体夹心 ELISA法检测 MP 抗原,该办法技能操作较简略,特异性也强,与种属附近的支原体没有穿插反响,用 PC 办法做平行测得,成果显现无明显性差异[12]。

2. 1. 2、选用荧光素符号的 P1 蛋白单克隆抗体检测痰或咽拭子标本中的 P1 蛋白抗原。此法特异性强,但单克隆抗体制备杂乱、技能要求高,还未遍及展开。

2. 2、肺炎支原体抗体检测

2. 2. 1、非特异性抗体试验

2. 2. 1. 1、冷凝聚试验 ( Cold agglutination test,CAT)一种确诊肺炎支原体感染的非特异性试验。冷凝聚素是抗红细胞 I 抗原的 IgM 抗体,在 0 ~4℃条件下可凝聚患者的 O 型红细胞或本身红细胞,在 37℃ 时呈可逆性的散开。大都肺炎支原体患者于感染后第 2 周血中冷凝聚素效价到达 1∶ 32 或更高,一般以效价达1∶ 64 或动态检测添加 4 倍以上时有确诊含义。抗体滴度和特异性随肺炎严峻程度添加。但本试验特异性不强,除肺炎支原体患者外,如传染性单核细胞增多症,肝病,溶血性贫血,流行性感冒,风疹,婴幼儿腺病毒、副流感病毒等引起的肺炎和呼吸道感染等病毒性疾病的患者,血中都可检测到冷凝聚素,呈现假阳性反响。因而,临床确诊价值不大,但因其办法简略,在长时刻内作为辅佐确诊肺炎支原体的办法,跟着检测技能的不断展开,现在已根本被筛选。

2. 2. 1. 2、MG 链球菌凝聚试验 肺炎支原体感染后,约有 1/3 的患者血清中可呈现能和甲型链球菌 MG 株凝聚的抗体,效价≥1∶ 20,而病毒性肺炎不呈现此抗体,有助于两者的差异。

2. 2. 2、特异性抗体试验 肺炎支原体感染后可发作特异性的 IgM、IgG 类抗体。其间 IgM 类抗体呈现最早,检测 MP - IgM 可作为前期感染的确诊目标,但重症感染及再感染者可能无此抗体发作。因而 MP -IgM 阴性不能否定 MP 感染,需检测 MP - IgG 和 IgA抗体,但特异性不如 IgM。

2. 2. 2. 1、补体结合试验 ( Complement fixation test,CFT) 人感染 MP 后,MP 的抗原糖脂成分影响机体发作特异性抗体,与肺炎支原体细胞膜成分致敏的绵羊红细胞结合构成固着补体使之不发作溶血反响,反之则激活补体,与后参加指示系发作溶血反响。抗体滴度在 1: 32 以上有确诊价值。补体结合试验的灵敏性高,特异性很好,缺点是初度感染时呈现阳性率高,再次感染时简略呈现假阴性反响。而且与生殖道支原体及嗜肺军团菌存在穿插反响,在某些神经系统疾病和急性胰腺炎时可呈现假阳性,且补体结合试验操作较繁琐,不适用于临床惯例检测。因而这种办法现在临应上不常用。

2. 2. 2. 2、被迫凝聚试验 是现在广泛运用于临床的确诊肺炎支原体感染的一种办法,大多运用由日本富士瑞必欧株式会社出产的 SEODIA@ 一 MYCOⅡ试剂盒。其选用肺炎支原体 ( Mac 株) 细胞膜成分致敏人工明胶粒子,经过致敏粒子与人血清中的 MP 抗体发作凝聚反响,操作简略,影响要素少,并尽可能消除以往被迫凝聚试验以动物红细胞为载体所引起的非特异性凝聚,凝聚图画明晰,过夜后再判读不发作明显改变,而且成果判别简略。具有操作简略、特异性强、设备要求低一级长处,较合适临床运用,是一项值得推行的技能。不足之处是该技能的灵敏度依然不行高,跟着 MP 特异性抗原的不断发现,被迫凝聚法确诊技能将愈加完善,检测灵敏度也必将前进。

2. 2. 2. 3、酶联免疫吸附试验 ( Engyme - linkedimmu-nosorbent assay,ELlSA) 酶免疫测定技能中运用最广的技能。ELISA 具有快速、灵敏、简洁、易于规范化等长处,运用于肺炎支原体,可检测 IgM 和 IgG 抗体,办法灵敏,特异性高,是确诊肺炎支原体感染有用牢靠的手法,现在已有多家厂商出售 ELISA 试剂盒,在临床上运用也很广泛。

ELISA 法是国内运用较为老练的试验办法,其有较高灵敏度的长处为我们长时刻所承受,但其反响时刻长,反响过程也相对较多,检出率虽与 PC 法检出率适当. 但也需求洗板机、酶标仪等设备,而且所需时刻较长。

2. 2. 2. 4、直接免疫荧光试验 ( Immuno - fluorescencetest,IFT) 免疫荧光技能是符号免疫技能中展开最早的一种。该办法是用 MP 在培育基上成长的菌落做抗原,检测 MP - IgM、IgG 抗体。该办法特异性高,但灵敏性稍差,而且需求置办荧光显微镜才干调查。

2. 2. 2. 5、金标渗滤法 ( GIFA) 和金标免疫层析法( GICA) 二者都是一种以胶体金作为示踪标志物运用于抗原抗体检测的免疫符号技能,反响原理根本相同。两种检测办法均无需任何仪器设备,操作简略方便,最合适一般底层医院展开运用,但成果陈述只能告之以阴性阳性,不能陈述滴度。

2. 2. 3、MP 外膜蛋白抗体测定 经过研讨证明 MP 的某些膜蛋白具有抗原性及免疫原性。P 蛋白是首要免疫原之一。Jocobs 用免疫印迹法剖析 MP 患者血清,发现在感染急性期、恢复期及感染后 5 个月能测出 P蛋白抗体,以为 P 蛋白可用于 MP 感染的试验室确诊。

3、肺炎支原体的分子生物学检测

跟着分子生物学的不断展开及试验确诊学的前进,分子生物学技能在支原体研讨范畴也被广泛地运用,展开了聚合酶链反响 ( PC) 和基因探针等分子生物学检测办法[13 -14],对疾病的医治起了较大的推进效果。

3. 1、聚合酶链反响 ( PC) 可分为一般 PC、荧光定量 PC、实时定量荧光 PC。1992 年 PC 法开端运用于 MP 感染的临床标本的检测,在 MP 感染前期确诊优于血清学试验和生物芯片法,被以为是确诊MP 感染的一种有价值的办法,但引物的挑选是要害。MP 含 DNA 和 NA 两种核酸,其基因组为环状双链DNA。Jensen 依据 16rNA 基因的可变区 P1 蛋白基因的序列规划出两对引物扩增上述两基因的一部分( 583 bp 和 153 bp) ,经试验证明此法快速、特异、灵敏[11],可检出≥10 cFu/ml 的 MP。

PC 法检测快速、特异性和灵敏性高,检测标本中的 MP 不需求是活体,不受患者免疫功用、病程、感染程度、有无运用药物医治及未到达血清检测水平的影响,可以更前期地检测到 MP 的感染,使 MP 的前期确诊和抗生素的正确挑选成为可能。对前期及未生成抗体者及抗体已消失的感染患者有活跃的含义;有助于前期确诊,及时医治,而且不存在穿插反响和放射性污染,易规范化。

尽管 PC 法检测快速,在某种含义上可代替培育法,但其高灵敏性也使 PC 法对试验环境和仪器要求比较高,存在着技能条件要求高、操作杂乱、不易遍及的问题,一般底层试验室难以展开,且价格也相对较高。

实时定量荧光 PC 将基因扩增的灵敏性以及分子杂交的特异性以及光化学的精确性合二为一来对肺炎支原体进行检测,经过基因技能,可以在较短的时刻内使含量极低的核酸片段扩展至数百万个复制,因而灵敏度、特异性均较高,且操作简略,是现在公认的精确性和重复性最好的核酸分子技能。

3. 2、基因探针 跟着分子生物学的展开,DNA 探针杂交技能被用于 MP 的检测,前进了特异性和灵敏性,但由于操作杂乱,又需防放射性污染,因而约束了它的临床运用。基因检测法的高灵敏性、高特异性在可以对微量样本和前期感染样本进行检测的一起,也简略由于操作不妥或环境要素而遭到污染导致成果的不牢靠,别的该法要求特别的仪器、较高的人员素质,也是约束其运用的要素。

3. 3、蛋白芯片法 蛋白芯片是近年来在生命科学范畴中敏捷展开起来的一项高新技能,是一种高通量、高灵敏度、高特异性,且微型化的蛋白质剖析技能。蛋白芯片剖析本质上就是运用蛋白质之间的相互效果对样本中存在的特定蛋白质进行检测,可一起快速发现多个生物符号物。但芯片法本钱高,一起很多不同蛋白质的高效表达与纯化问题有待前进。

蛋白芯片法检测肺炎支原体感染具有重复性好、操作简洁、快速等长处[15],可是运用蛋白芯片技能关于蛋白质功用的研讨依然存在着种种问题。因而,蛋白质芯片法检测肺炎支原体感染的临床运用价值还需求进一步探究。

4、肺炎支原体的活体检测

运用超高倍显微镜直接检测肺炎支原体,该办法经济、简洁、快速、直观,并配有彩图,最大极限地添加了患者的信赖度[16 -17]。病理研讨证明肺炎支原体是呼吸道及其他器官感染的重要病因之一。支原体肺炎的医治要害在于及时确诊并予以针对性医治,可以在前期快速地对感染MP 的患者进行确诊,防止乱用抗生素,给患者供给及时有用的治疔,减轻患者的经济负担,所以树立有用、灵敏的前期检测办法十分重要。

综上所述,跟着科学技能的不断展开,检测肺炎支原体的办法日益增多,各有其优缺点。传统的别离培育办法要求高、灵敏性低、耗时长等,约束了其在临床上的运用。免疫学检测,其特异性和灵敏性适中,简洁方便,特别是血清被迫凝聚试验和 ELISA这两种检测办法更为合适一般试验室惯例检测。分子生物学检测法具有高灵敏性和高特异性、检测快速,在某种含义上可代替培育,但其高灵敏性也对试验环境和仪器要求高,其高假阳性限制了办法的广泛运用。这就要求在挑选试验办法时,要依据各自试验室的技能条件和经济条件挑选灵敏性和特异性相对较高,又合适临床检测要求的检测办法,必要时结合患者的临床表现,可选用一种或多种办法联合检测。

参 考 文 献
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